Que se passe-t-il derrière ces murs ? Cette question fondamentale a fasciné des générations de botanistes depuis la première observation microscopique de cellules végétales en 1665, et elle en divertira sûrement bien d’autres dans les siècles à venir. Depuis, nous avons beaucoup appris sur le fonctionnement interne des plantes. Pourtant, bon nombre de ces découvertes n’ont pas été réalisées par imagerie directe mais plutôt par des mesures indirectes suivies d’une déduction raisonnable. Les représentations colorées des processus intracellulaires trouvées dans les manuels scolaires sont, dans une large mesure, des approximations de ce qui peut être conclu après avoir extrait le contenu cellulaire, l'avoir secoué dans des tubes à essai avec des produits chimiques, passé ce cocktail dans des machines coûteuses et examiné les chiffres de ces instruments. cracher assez longtemps. Ce ne sont pas des images réelles de ce qui est mais des imaginations réfléchies de ce qui pourrait être. Pendant longtemps, les scientifiques les plus proches d’une représentation réaliste étaient des images cytologiques prises à partir de préparations histologiques de tissus morts après fixation et coloration. Il s’agissait d’instantanés momentanés figés dans le temps et l’espace et ne révélant rien des processus dynamiques, laissant les chercheurs dans l’ignorance des activités internes qui définissent la vie.

Pourtant, un moyen de rendre visible l’invisible avait déjà été découvert au milieu du 19^th-siècle par le physicien George Gabriel Stokes dans une solution de quinine. Le liquide transparent et incolore s’éclairait d’un bleu céleste lorsqu’il était placé à l’extrême limite d’un spectre de lumière solaire dispersé par un prisme. Impressionné par ce dont il avait été témoin, Stokes a écrit : «C'était certainement un spectacle curieux de voir le tube s'allumer instantanément lorsqu'il était plongé dans les rayons invisibles.: c'était littéralement l'obscurité visible. Dans l’ensemble, le phénomène avait une apparence surnaturelle..» C’est ce phénomène qui s’émerveille aujourd’hui dans les boîtes de nuit lorsqu’ils dégustent leur gin tonic à côté d’une lumière noire, celui-là même qui a élevé un biologiste marin japonais au rang des prix Nobel et celui qui détient le pouvoir d’éclairer la dynamique intracellulaire. et révolutionné la biologie moléculaire.

Stokes a qualifié l'émission de lumière qu'il a observée de « fluorescence ». Elle se produit lorsque certains atomes ou molécules sont excités par une lumière d'une longueur d'onde particulière et émettent une lumière d'une longueur d'onde plus longue après un temps très court. Environ un siècle après Stokes, Osama Shimomura a collecté près de 10,000 XNUMX spécimens de méduses. Aequorea victoria dans les eaux du Pacifique pour résoudre le mystère de la lueur séduisante de l'animal et extraire avec succès une protéine fluorescente verte (GFP). Il faudra encore environ 30 ans avant que la GFP soit séquencée et clonée, ce qui permettra son expression dans d'autres organismes et en fera un outil aujourd'hui indispensable pour la lutte non invasive. in vivo analyse des activités physiologiques au niveau sous-cellulaire ou organisme.

La mutagenèse dirigée sur le site de la GFP originale a donné naissance à une vaste gamme de molécules produisant de la fluorescence, appelées fluorophores, dotées de différentes propriétés photophysiques. Différentes protéines peuvent ainsi être visualisées simultanément à l’aide d’étiquettes fluorescentes spectralement distinctes. Non seulement leur localisation mais aussi toute interaction potentielle entre les protéines d’intérêt sont ainsi détectables. Pour que les protéines interagissent, elles doivent être très proches, de quelques nanomètres seulement. Lorsque la distance entre les fluorophores attachés devient suffisamment petite, l'énergie d'un faisceau laser absorbé par l'un peut être transférée à l'autre, ce qui diminue la durée de vie de la fluorescence et le rendement d'émission lumineuse du fluorophore donneur et augmente la fluorescence de l'accepteur. Ce transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est enregistré et analysé en microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM), une technique qui permet aux chercheurs de mesurer la durée pendant laquelle un fluorophore reste dans l’état excité avant de produire de la lumière.

Cependant, l’utilisation de l’analyse par fluorescence dans les plantes est notoirement difficile en raison de la forte autofluorescence interne de composés tels que la chlorophylle ou la lignine des parois cellulaires. Les signaux provenant de protéines peu abondantes et marquées par fluorescence sont donc souvent noyés par la « pollution lumineuse » interne. Les solutions de contournement visant à augmenter le rapport signal/bruit, telles que l'expression de protéines sous des promoteurs plus puissants, peuvent facilement conduire à des artefacts et à une mauvaise interprétation des données.

Pour surmonter ces limites, le Dr Elena Kristin Petutschnig et ses collègues ont établi une nouvelle paire de fluorophores Dotés de propriétés supérieures, qu'ils ont récemment présentées dans le Journal of Experimental Botany, le donneur fluorescent mCitrine et l'accepteur mScarlet-I (nommés d'après leurs émissions de lumière jaune et rouge respectives) présentent des spectres d'absorption et d'émission de lumière qui se chevauchent, condition essentielle à l'étude des interactions protéiques par FRET/FLIM. Leur excellente luminosité les rend idéaux pour les protéines faiblement exprimées. Les auteurs ont validé la fonctionnalité des fluorophores en utilisant deux composants d'un complexe récepteur cellulaire qui détecte un composé fongique et déclenche une réponse de défense chez la plante, et ont révélé des détails jusqu'alors inconnus sur l'interaction entre ces composants. Ce couple de fluorophores s'avère ainsi capable d'éclairer d'un jour nouveau les processus intracellulaires, et ces travaux offrent un potentiel considérable pour mieux comprendre les mécanismes se déroulant au sein des parois cellulaires végétales.

LISEZ ENTIÈREMENT L'ARTICLE:

Petutschnig EK, Pierdzig L, Mittendorf J, Niebisch JM, Lipka V. 2024. Une nouvelle paire de protéines fluorescentes facilite l'analyse FLIM-FRET de l'interaction des récepteurs immunitaires végétaux dans des conditions natives. Journal de botanique expérimentale 75, 746-759. https://doi.org/10.1093/jxb/erad418

Mareike Jezek

Le Dr Jezek est rédacteur adjoint au Journal of Experimental Botany, l'une des revues officielles du Société de biologie expérimentale.